質粒構建 | 從入門到精通

質粒構建0340;原ĩ02;

0240;

外源 DNA 經 PCR 擴增後，用限製性內切酶分029;切割載體和外源 DNA 片段，DNA 連接酶將0108;者進行連接，然後轉入宿027;細菌，通過篩選鑒定獲得重組克隆。經過一係015;0340;操0316;，「快遞員{01;質粒ì01;完成0102;呈遞目標片段0340;037;0316;。

質粒構建流程034;意圖

0240;
0240;

質粒構建0340;步驟

0240; 「快遞」目標片段的過程主要有三個步驟：
0240;▼▼▼
0240;
0240;
0240;
0240;

01

PCR 擴增

0240; 「快遞」準備，首先要對目標片段進行擴增富集。PCR 即聚合酶鏈式反應，它是一種用於擴增複製特定 DNA 片段的常用分子生物學技術。PCR 的最大特點是能將微量的 DNA 大幅擴增，在克隆前獲得大量的目標基因片段。
0240;
0240;PCR 擴增
0240;
0240;
0240;

簡要步驟：

033;用引物設計軟0214;如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在線設計引物並合成後，配製 PCR 反033;體係：將模板、引物、dNTP、酶、反033;緩衝液和 ddH₂O 按比0363;加入，加好後輕微點離，放入 PCR 儀中擴增目0340;片段，擴增後通過瓊!026;糖凝膠檢測目0340;片段大小是否正確。

0240;

Tips

▼
0240;擴增過程中的關鍵點 ▼
0240;
0240;

Q

PCR 擴增中隨著拷貝數的增加經常會出現二聚體、非特異性條帶（大小不對）的現象。

答案

A：通過降0302;模板和引物濃度、降0302;鎂離子濃度、適當減少酶量，提高退火溫度，可以提高擴增特異性。此外引物設計0340;好壞是關鍵。除É02;按031;常規引物設計規則外，構建載體時通常會在引物序列上添加酶切0301;點和保ť03;堿基。

常規引物設計原則

1. 引物長度：18-30bp，常用 20-22bp 038;右。

2. 引物 Tm 值最好在 60℃ 038;右，兩條引物間 Tm 值要保持接近，最好不超過 5Ⰳ。

3. GC 含量 40%-60%，45-55% 為0339;。

4. 引物自身不033;有連續 4 個及以上堿基0340;互#036;，避免形成0332;卡結構。

5. 引物之間不033;有連續 4 個及以上堿基0340;互#036;，避免形成引物二聚體。

6. 3' 端避免連續堿基0340;重複，如 GGG 或 CCC 會導致錯配0340;0332;生。

7. 3' 端最後一個堿基最好是 G 或 C。

8. 可0351;用 NCBI primer-blast 比對引物特異性。

一般在引物0340; 5′ 端添加酶切0301;點時（不影響擴增0340;特異性），根據酶切0301;點序列，需要添加不同種類和數量0340;保ť03;堿基，多加 3 個堿基可以滿足幾乎所有限製性酶切要求，如常用 BamHI（CGCGGATCCGCG）,其保ť03;堿基為藍色部分。上下遊引物最好加入不同0340;酶切0301;點，避免片段在連接過程中倒置，影響基因序列0340;正常表達。

0240;

Q

擴增0340;片段ý02;尾嚴重，產物在凝膠上出現彌散狀態。

答案

A：原因可!021;在於模板不 020;、反033;體係中各成分比0363;不合適、退火溫度設置偏0302;、循環次數過多等。注意操作輕柔，PCR 擴增體係各組分嚴格參照說明書加入。

0240;

Q

片段太長難擴增、0332;生錯配概率大、測序出現點突變？

答案

A：擴增中設置適宜0340;退火溫度（60℃ 038;右），循環次數（30 次038;右）不要太多，酶量要適中。傳統 Taq 酶便宜高效，0294;擴增長度有限，出錯率高。針對少量模板、複雜模板、長片段、穩定性差模板、高 GC 含量模板0340;擴增，選取具有高擴增!021;力、高保真、可靠性強0340;聚合酶是解決問題0340;重要一環。

0240;

02

酶切酶連

0240; 獲得目標片段後，要交到「快遞員」手中，必須借助兩個工具來實現——酶切037;具（限製性內切酶）和連接037;具（DNA 連接酶）。
0240;
0240;酶切酶連
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0240;
0240;

簡要步驟：

配製瓊脂糖凝膠（常用濃度 1-2%）後點樣，切膠電泳回收目的片段，選擇合適的內切酶將目的片段和質粒載體同時切割，酶切後的片段再次電泳回收，測定濃度後按比例加入 T4 DNA 連接酶，粘性末端載體、目的片段、緩衝液，進行連接後直接轉化。

0240;

Tips

▼ 酶切酶連技術關鍵點 ▼
0240;
0240;

Q

實驗中遇到雙酶切，經常會出現分開酶切費時費力（步驟繁瑣），酶切時間長，產生星活性等問題；而雙酶切也有可能（緩衝體係和最佳溫度不同）產生酶切不完全現象。

答案

A：選取可保證兩種酶活性0340;緩衝液是關鍵，既保證酶切效率又可以避免酶切過久。加樣五分鍾，酶切兩小時甚至過夜，漫長的等待總讓人焦躁不安。所以，選擇一款優質內切酶至關重要。

0240;

Q

目標片段和載體總是連接不上，連接效率差？

答案

A：根據公式計算出目標片段和載體的加入量，切勿隨意添加。

目標片段和載體加入量0340;計算公式

點擊圖片查看詳細信息

0240;

03

轉化鑒定

0240; 「快遞」已打包，「快遞員」已就位，如何讓包裹高質高效的送達？這就不得不借助
0240;
0240;快速轉運工具——感受態細胞。
0240; 常見的感受態細胞非
0240;
0240;TOP10、DH5€BL21
0240;莫屬了，他們可是轉運過程的小能手，負責質粒的克隆和表達。
0240;
0240;轉化鑒定
0240;
0240;
0240;

轉化及鑒定簡要步驟

將連接產物加入感受態細胞，冰上放置30min、42°C 熱激轉化或電轉化，加入無抗性 LB 培養基，200rpm -37°C 搖床搖 45-60min 後，塗至抗性或者其他篩選平板上，37°C 培養過夜、挑取 3-5 單個克隆搖菌、菌落 PCR 或提取質粒後酶切鑒定、鑒定完畢後送質粒或菌液測序驗證。

轉化鑒定簡易流程

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Tips

▼ 轉化及鑒定小貼士 ▼
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Q

轉化後克隆數量少？

答案

A：對於初學者，設置陰性和陽性對照很有必要。克隆過程中，陰性對照-空載長出菌落，判定可能是酶切不完全導致，陽性對照不出斑，轉化實驗的操作可能出現問題。感受態細胞切勿反複凍融，且熱激時間很重要，一定要精準到秒，同時正確使用抗生素或其他篩選標記。

Q

菌落太多但假陽性率高，總是挑不到正確的克隆。

答案

A：PCR 鑒定正確後測序卻不對，假陽性克隆太多，選擇行之有效的鑒定方法有小妙招。菌落 PCR 鑒定引物需跨區域設計，一條引物設計在載體上，另外一條在目標片段上，即可避免假陽性克隆又篩除反向插入片段，此外還可以通過提取質粒酶切跑膠進一步排除錯誤克隆。

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質粒構建，實驗看似簡單卻總會出現各種問題，上麵總結的隱藏技能，希望能幫助大家順利完成實驗。

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0240;
0240;讀懂質粒：
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拷貝數

對於質粒載體，拷貝數是我們最關心的特性之一。實際上，每個細菌中的質粒的拷貝數主要決定於質粒本身的複製特性。按照複製性質，可以把質粒分為兩類：

嚴緊型質粒：當細菌染色體複製一次時，質粒也複製一次，每個細菌內隻含1～2個質粒；

鬆弛型質粒：當細菌染色體複製停止後仍然能繼續複製，每一個細菌內一般含20個左右質粒拷貝。這些質粒的複製是在寄主的鬆弛控製之下的，每個細菌中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑製寄主蛋白質的合成還可使質粒拷貝數增至幾千份。

當然，恒定的拷貝數與質粒複製控製係統、質粒的大小及培養條件有關。

那麽到這裏你可能會問，高拷貝質粒我們可以多提一點質粒，低拷貝數的質粒有什麽作用呢？確實，低拷貝數的質粒用途不是十分廣闊，主要用於以下兩點：

1. 高拷貝數的質粒往往不穩定，進行大片段克隆或者帶有毒性DNA克隆時會用低拷貝；

2. 質粒的擴增會占用大量資源，當載體用於表達或者其他用途時，也會使用上低拷貝質粒。

質粒的接合轉移與穿梭質粒

質粒的接合轉移：是細菌遺傳物質轉移的一個重要方式。在質粒轉移過程中，供體菌和受體菌通過結合作用緊密接觸，質粒從供體細胞向受體轉移，同時進行質粒複製。按能否自主轉移，可以將天然存在的質粒分為轉移型質粒和非轉移型質粒兩大類。

這裏要注意的是，獲得質粒的細菌可隨之而獲得一些生物學特性，如耐藥性或產生細菌素的能力等。從環境友好出發，實驗室裏的廢棄菌液，一定要滅過菌才能倒哦。

穿梭質粒：是指一類人工構建的具有兩種不同複製起點和篩選，因而可以在兩種不同類群宿主中存活和複製的質粒載體。此概念不僅用於不同的微生物菌群之間，也可以推廣到真核生物表達載體的構建，如用於枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳動物表達載體pMT2 和用於植物細胞的Ti 質粒。這些穿梭質粒不僅可以在大腸杆菌中複製擴增，也可以在相應的枯草、酵母、動物或植物細胞中擴增和表達。這樣利於對質粒的分子生物學操作和大量製備。

質粒的不相容性

通俗來說，就是一山不能容二虎。但是作為科學來說，我們需要一個嚴謹的定義。

“利用同一複製係統的兩個質粒會在複製和隨後向自細胞的分配過程中彼此競爭，這樣的質粒在細菌培養物中不能和平共處，這種現象稱之為不相容性”。

那要怎麽才能在一個菌裏麵使用兩個質粒呢？簡單的方法就是使用不同複製源的且帶有不同抗性基因的兩個質粒。

如何讀懂一個質粒

如何讀懂一個質粒，我們以下圖慢病毒質粒為例說明：

質粒圖譜由吉滿生物提供

1. 
   0240;pUC ori：複製起始點，pUC為高拷貝表達質粒（120-200個/細胞）。

2. Amp：氨苄抗性，為原核抗性，用於質粒抽提時的篩選。

3. U6 promoter：U6啟動子，真核啟動子，啟動shRNA的表達。

4. CMV：真核啟動子，啟動ZsGreen1的表達。

5. ZsGreen1：第三代綠色熒光蛋白，亮度最高的的熒光蛋白。

6. PGK：真核啟動子，啟動Puro的表達。

7. Puro：嘌呤黴素抗性基因，真核抗性，用於質粒或病毒進入細胞後的篩選。

8. Amp：氨苄抗性基因，原核抗性，用於質粒抽提時的篩選。

9. WPRE：轉錄後調控序列，增加外源片段的表達效率。

10. 3’LTR、5 LTR：逆轉錄病毒基因組兩端各有一個長末端重複序列(5 —LTR和3 —LTR)，不編碼蛋白質，含有啟動子，增強子等調控元件。

質粒圖譜哪裏去找？

方法一：使用 Vector NTI 軟件

這款軟件的軟件包裏包括常見和經典的質粒圖譜。要想對質粒圖譜了解更直觀，安裝這款軟件是非常必要的。

方法二：查找質粒圖譜的網站

Addgene
0240;地址：http://www.addgene.org/

Vector DB

網址：http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html

此網站頁麵比較簡陋，但分類比較直觀，總結和分類都比較完整。基本包括了所有表達係統的質粒信息。

NCBI

網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

這個名氣太大就不介紹了。

Google 及 Google 學術

檢索式：質粒名 + map 質粒名 +sequence +filetype:txt or filetype:pdf 或者：進入 google，點擊「圖片搜索」，直接查找圖譜。

其他的一些核酸數據庫

歐洲分子生物學實驗EMBL：http://www.ebi.ac.uk/

方法三：如何查找改造過的質粒的質粒圖

有些質粒是經過改造的，所以通過上述方法不能查詢到相應信息。這時，可以在 google scholar 中輸入質粒名稱，可以直觀地看哪些學者在何文章中使用了該質粒，從而可了解到質粒的來源或者籍此向作者谘詢或索取。

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